終結病毒成功感染的第一步  光學與電子顯微鏡的完美結合

病毒不能自行繁殖,需要透過宿主細胞的內部機制,進行複製和傳播。病毒感染的第一步需要多進行多步驟的機制,結合到宿主細胞表面,才能將自身轉運到細胞內。

David-Alsteens-868x1024.jpg利時分子科學家Dr. David Alsteens小組與美國匹茲堡大學的同事最近在《Nature Communications》上發表了研究成果,首次結合共聚焦(Confocal)和原子力顯微鏡(AFM)運用在活細胞上的研究,並了解病毒如何結合在細胞表面。

以下是專訪Prof. Dr. David Alsteens的提問內容與應答:
請大致描述實驗室的研究目標? 以及期刊的研究如何符合您的整體實驗?
Prof. Dr. David Alsteens的回答:
我們實驗室‘NanoBiophysics lab’的目標,是利用營造真實的環境下,了解細胞表面發生的複雜生物過程。為此,我們將原子力顯微鏡(AFM)和點掃描共聚焦顯微鏡(Confocal)結合,藉由定位分子、受體和細胞,同時繪製它們的奈米力學特性或原子力顯微鏡探針與生物樣品之間的生物物理作用。
多年來,我們一直在使用基於力距離的AFM研究分子和細胞水平的多種生物樣品,以利理解單分子的相互作用及驅動生物的過程。
alsteens-lab-1024x768.jpg
 
我的實驗室目前關鍵的應用包括:對G蛋白(G-protein)偶聯受體進行成像,同時定量其配體結合自由能態,研究病毒進入動物細胞的第一步(呼吸道腸道病毒、輪狀病毒、皰疹病毒、伊波拉病毒樣顆粒等),重點是希冀了解在活細胞表面建立的動力學過程。

我們最近刊登的期刊,非常適合說明實驗室的主要研究方向,自從我在瑞士蘇黎世的ETHZürich擔任博士後以來,我們進一步開發了最新一代的Bio-AFM與高分辨率光學顯微鏡的組合,我們的目標是開發一種新的生物物理學和病毒學方法,以高分辨率直接在活細胞上研究病毒如何進入,並提供有關細胞感染早期步驟的分子細節的定量信息。
在我們最近的工作中,我們結合了最新一代的共聚焦雷射掃描顯微鏡(CLSM)和AFM,以遵循單一病毒進入的早期步驟。我們還成功地以定量方式描述了這些第一步,並提供了病毒-受體相互作用的動力學和能量參數。

您能否以通俗易懂的方式描述光學共軛焦和AFM技術的結合,如何在此期刊中的貢獻?
Prof. Dr. David Alsteens的回答:
由於原子力顯微鏡與共聚焦顯微鏡的結合,我們研究了呼吸道腸道病毒(reoviruses)在細胞培養條件下與哺乳動物細胞表面的相互作用。藉由一個非常尖銳的探針接觸與輕壓表面,反作用力使得探針的懸臂產生偏折,而偏折量的大小代表反作用力的大小,便能推算出包括聚醣和受體在內的細胞表面成分的作用力(圖1)。
AFM-tip-with-single-virus.png
 
與共聚焦顯微鏡的結合使我們可以實際跟蹤AFM尖端在細胞上的位置以及某些螢光標記受體的定位。原子力顯微鏡針尖縮回後,病毒開始與受體分離,並在縮回運動期間監測針尖的偏轉,其偏轉與病毒和受體之間的作用力成正比,因此使我們能夠定量結合強度,然後詳細分析測得的結合力,並獲得以動力學和能量方式描述相互作用的參數,另外,我們還可以藉此確定病毒與細胞之間已形成的鍵結數目(圖2)。
probing-reovirus-binding-1024x241.png

總之,這項研究使我們在了解呼吸道腸道病毒(reoviruses)與細胞的結合機制方面取得了重大突破。我們首次展示了呼吸道腸道病毒(reoviruses)與細胞表面的早期結合是由聚醣(稱為附著因子(呼吸道腸道病毒的唾液酸))調節的。到現在為止,這些相互作用通常被忽略,被視為非特異性相互作用,其作用是將病毒集中在細胞表面。但是,這些鏈接不僅僅像以前認為的“簡單的束縛或非特定步驟”。

我們的研究強調了附著因子(α-連接的唾液酸聚醣[α-SA])與特定進入受體(連接黏附分子A [JAM-A])之間的生理相互作用。我們的體外和細胞實驗顯示了協同作用。以低親和力結合的與病毒糖蛋白結合的α-SA充當了初始附著事件,並進一步觸發了病毒糖蛋白的構象變化(conformational change)。糖蛋白採用了更廣泛的構象變化,從而促進它與高親和力JAM-A受體的特異性相互作用。此外,我們發現,由於糖蛋白的構象變化,短唾液酸化聚醣(short sialylated glycans)誘導呼吸道腸道病毒受體結合增強。這導致結合親和力和最終傳染性增加,可將其用於未來的疫苗和溶瘤治療。

您在出版物中提到,這些見識可能導致呼吸道腸道病毒(reoviruses)被用作溶瘤劑–您能對此進行詳細說明嗎?
Prof. Dr. David Alsteens的回答:
癌症治療的主要手段,如化學療法,放射療法,甚至靶向酵素抑製劑和單株抗體,都因細胞抵抗力和毒性受到限制,因而缺乏功效。溶瘤病毒療法提供了一種新穎的治療策略,除了有廣泛的抗癌活性,同時具有最小的人為毒性,可以顯著改善臨床結果。

呼吸道腸道病毒(reoviruses)是治療發展的候選藥物,目前處於第III期試驗中呼吸道腸道病毒(reoviruses)以活化的Ras信號通路選擇性靶向轉化細胞。 Ras基因是人類癌症中最常見的突變致癌基因之一,統計可知人類腫瘤中至少有30%表現出異常的Ras信號傳導。通過靶向Ras活化的細胞,呼吸道腸道病毒(reoviruses)可以直接裂解癌細胞,破壞腫瘤的免疫抑制機制,重新建立多細胞免疫監視並產生強大的抗腫瘤反應。呼吸道腸道病毒(reoviruses)的第I期臨床試驗已顯示出療效的跡象,目前正在進行若干第II / III期試驗。呼吸道腸道病毒(reoviruses)在臨床上具有廣泛的臨床前功效、複製能力和低毒性的特性,成為臨床測試中受關注的抗癌治療劑。
儘管我們對呼吸道腸道病毒(reoviruses)複製以及殺死轉化的細胞的機制有新的了解,在知識上仍有許多空白,可藉由調控與研究呼吸道腸道病毒(reoviruses)的結合效率和針對疫苗和溶瘤藥物的感染性尋求進一步的解答。

原文出處: https://blogs.zeiss.com/microscopy/en/confocal-afm-viral-entry/

聯絡我們